七彩虹c.h110m-t与k:免疫分析技术和相关仪器

4.1．酶免疫分析仪
4.1.1酶免疫分析技术的分类
    酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA) 是目前临床应用最多的一类免疫分析技术，可分为非均相(或异相)酶免疫测定和均相酶免疫测定两种方法。
均相酶免疫分析法（homogeneous enzyme immunoassay，HEI） 均相酶免疫分析主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种方法。
    非均相酶免疫分析法（heterogeneous enzyme immunoassay） 常用的酶免疫分析法多为非均相法，又可分为液相酶免疫法和固相酶免疫法两种，以后者最常用，称为酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA是临床上最常用的免疫分析方法，目前常用的酶免疫分析仪都是基于ELISA技术，称为酶免疫分析仪。
4.1.2酶免疫分析仪的类型、工作原理及基本结构
    根据仪器结构和自动化程度, 针对固相支持物的不同（如微孔板、试管、小珠、磁微粒等）作为吸附免疫试剂的载体，因而设计成不同的酶免疫分析仪，其基本工作原理就是分光光度法，在光电比色计或分光光度计的基础上根据ELISA技术的特点而设计。包括：
    微孔板固相酶免疫测定仪器 国际上微孔板式ELISA使用的载体为96孔板，采用直接对微板孔测定吸光度（A）的比色计。
(1) 酶标仪
    酶标仪也称为ELISA测读仪（ELISA reader）,有单通道和多通道两种类型。自动型多通道酶标仪有多个光束和多个光电检测器，检测速度快。如8通道的仪器，设有8条光束（或8个光源）、8个检测器和8个放大器。多通道酶标仪的检测速度较快。
    酶标仪的工作原理与主要结构和光电比色计几乎完全相同（见图16-1）。既可以使用和分光光度计相同的单色器，也可以使用干涉滤光片来获单色光，此时将滤光片置于微孔板的前、后的效果是一样的。

图16-1 酶标仪工作原理

    酶标仪的工作原理和光路与普通光电比色计的不同之处在于（见图16-2） ：比色液的容器不是比色皿，而是用塑料微孔板；酶标仪以垂直光束通过微孔板中的待测液；酶标仪通常使用光密度OD来表示吸光度。现在大部分的酶标仪还加上了判读系统和软件操作分析系统等。

图16-2 酶标仪光路系统简图

(2) 半自动微孔板式ELISA分析仪
    半自动微孔板式ELISA分析仪在酶标仪的基础上再配置加液器、温育器、洗板机和测读仪等分别组成。测定中需由手工将微孔板移至下一步骤的仪器中进行。洗板机要求洗涤后固相表面非特异性物质洗涤干净，吸液后每孔中残留的液量极小。较精密的洗板机有可调节的定时、洗涤液定量及振荡微孔板的功能。
(3) 全自动微孔板式ELISA分析仪
    自动化酶免疫分析系统由加样系统、温育系统、洗板系统、判读系统、机械臂系统、液路动力系统、软件控制系统等组成，这些系统既独立又紧密联系。全自动微孔板式ELISA分析仪用在大批量标本的检测中，不但提高了工作效率，而且测定的精密度亦得到改善。微孔板式ELISA仪器均为开放式的，即适用于所有微板式ELISA试剂。ELISA检测结果的精密度主要取决于试剂的质量。全自动ELISA仪器本身的精密度一般在3%左右。应用优质试剂测定结果的精密度，定量测定可达到7%以下；常用的定性测定为感染性疾病抗原、抗体的检测，精密度在10%左右。
（4）管式固相酶免疫测定仪
    应用管式固相载体的ELISA分析仪器不多，在我国应用的有：
① 1990年德国推出的全自动管式ELISA分析系统和配套试剂。试剂包括用链霉亲和素包被的聚苯乙烯管、生物素结合的抗原或抗体，辣根过氧化物酶标记的抗体和显色底物ABTS。测定中标准曲线可使用2星期，每次测定只需一点定标。测定的精密度CV在3%左右。测定项目齐全，包括激素、肿瘤标志、心肌标志和感染性疾病的抗原、抗体等。② 法国生产的是一种特殊形状的管式全自动ELISA的分析仪，配套使用一个特别的“试剂条”（reagent strip）。
（5）微粒固相酶免疫测定仪
    美国生产自动酶免疫分析仪应用聚苯乙烯微粒（颗粒直径0.47μm）作为固相，特异抗体或抗原包被在微粒上。第一次抗原抗体反应后，将反应液通过特制的玻璃纤维膜，聚苯乙烯微粒吸附在玻璃纤维膜上，液体则通过膜滤出。以后的反应在膜上进行，用过滤方式洗涤。标记酶为碱性磷酸酶，底物为4-甲基伞酮磷酸酶，反应后进行荧光测定。其后生产的作药物测定的荧光偏振分析仪与一体多项目全自动免疫分析仪也在检验实验室广泛应用。
（6）磁微粒固相酶免疫测定仪
    磁微粒可用磁铁吸引与液相分离，是免疫测定中较为理想的固相载体，较早应用磁微粒作为酶免疫测定固相的是瑞士出品的分析系统，由分光光度测读仪、磁铁板和试剂3部分组成。试剂包括抗异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，特异抗体或抗原包被的磁微粒（颗粒直径1μm），FITC结合的特异抗体或抗原，碱性磷酸酶标记的特异抗体或抗原及底物酚肽（phenolphthalein）磷酸酯。其应用的抗FITC-抗体是与亲和素-生物素原理相同的间接包被系统，反应模式与电化学发光免疫测定亦相似。反应在试管中进行，基本上用手工操作。反应结束后将试管架放在磁铁板上，磁微粒被磁铁吸引至管底，完成固相与液相的分离。酶作用后反应液呈粉红色。
4.1.3 酶免疫分析仪的性能评价和维护保养
    评价指标和方法
（1）滤光片波长精度检查及其峰值测定
（2）灵敏度和准确度 灵敏度 准确度
（3）通道差与孔间差检测 通道差检测 孔间差的测量
（4）零点飘移
（5）精密度评价
（6）线性测定
（7）双波长评价
（8）全自动酶免分析仪的主要技术参数应达到如下要求：
    可随机安排项目检测，每板上可同时做8个相同条件的项目检测。可用加样针或Tip头加样；加样速度应>700个／h；加样体积为：用针时2μl~300μl，用Tip头时10μl ~300μl，精度均为1μl可调；加样精度为：用针时CV<1％，用Tip头时CV<2％。试剂加样速度应2800孔／h；加样体积2μl~300μl ，精度为lμl 可调；加样精度为100μl 时，CV<2％。有液面感应装置。标本架为可移动架，可同时放置92管标本。标本架中心为12个可移动的试剂架，并有8个稀释液架。有标本识别的条码阅读器，温育系统有可控温在200C ~400C的平台加热器，温度设置误差在±0.50C内，有>4个加热孵育板位，轨道式振荡，每个板位独立控温，互不干扰。洗板机液残量控制在2μl 以内。滤光片吸光度范围为0~3.0D。
酶免疫分析仪的维护
    酶免疫分析仪维护的重点是在光学部分，防止滤光片霉变。应定期检测校正，保持其良好的工作性能。
4.1.4 酶免疫分析仪的临床应用
1.病原体及其抗体的检测
2.各种免疫球蛋白和细胞因子、补体等
3.肿瘤标志物
4.多种激素
5.药物和毒品
4.2发光免疫分析仪
    发光免疫技术根据示踪物检测的不同而分为荧光免疫测定、化学发光免疫测定及电化学发光免疫测定三大类。化学发光免疫根据标记物的不同，有化学发光免疫分析、微粒子化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和生物发光免疫分析等分析方法。现临床以前三者较为常用。本节主要介绍目前国内临床应用较多的化学发光免疫分析仪和电化学发光免疫分析仪。
4.2.1发光免疫分析的种类和基本原理
4.2.1.1 发光免疫分析的基本种类
    根据标记物的不同有下列几种分析方法：
1．化学发光免疫分析 其标记物为氨基酰肼类及其衍生物如5—氢基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)等。
2．化学发光酶免疫分析 先用辣根过氧化物酶标记抗原或抗体，在反应终点时再用鲁米诺测定发光强度。
3．微粒子化学发光免疫分析 其标记物为二氧乙烷磷酸酯等。
4．生物发光免疫分析 荧光素标记抗原或抗体，直接或间接参加发光反应。
5．电化学发光免疫分析 所采用的发光试剂标记物为三氯联吡啶钉[Ru(bpy)3]2++N羟基琥珀酰胺酯。此种方法较常用。
4.2.1.2 发光免疫分析基本测定方法
    根据发光反应检测方式的不同可分为下列主要的测定方法。
1．液相法 免疫反应在液相中进行，反应后经离心或分离措施后，再进行测定发光强度。所用分离方法包括葡聚糖包被的活性炭末、SephadexG—25层析柱、第二抗体等。
2．固相法 将抗原抗体复合物结合在固相载体(如聚苯乙烯管)或分离介质上(如磁性微粒球、纤维素、聚丙烯酰胺微球等)，再进行测定发光强度，此法较常用。试验原理与固相RIA和ELISA方法基本相同。
3．均相法 如同均相酶免疫测定一样，在免疫反应后，不需要经过离心或分离步骤，即可直接进行发光强度检测。其原理是某些化学发光标记物(如甾体类激素的发光标记物)与抗体或蛋白结合后，就能增强发光反应的发光强度。
4.2.2 发光免疫分析仪的种类、工作原理和基本结构
    重点介绍全自动化学发光免疫分析系统、全自动微粒子化学发光免疫分析系统和全自动电化学发光免疫分析仪。
4.2.2.1 全自动化学发光免疫分析系统
    全自动化学发光免疫分析系统采用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的免疫分析系统。在90年代初首次应用 后又不断改进，将微机与主机分开，软件程序加以改进，使操作更灵活，试剂贮存时间长，结果准确可靠，自动化程度高等优点。
1．仪器测定原理 该类分析技术有两种方法，小分子抗原物质测定采用的是竞争法，而大分子抗原物质测定采用的是夹心法。仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm。这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便。其反应基本过程有： (1)竞争反应 (2)夹心法
2．仪器组成 一般由主机和微机两部分组成。
（1）主机部分：是仪器的运行反应测定部分，包括原材料配备部分、液路部分、机械传动部分、光路检测部分。材料配备部分包括反应杯、样品盘、试剂盘、纯净水、清洗液、废水在机器上的贮存和处理装置；液路部分包括过滤器、密封圈、真空泵、管道、样品及试剂探针等；机械传动部分包括传感器、运输轨道等；电路部分包括光电倍增管和线路控制板。
（2）微机系统 是仪器的核心部分，是指挥控制中心。其功能有程控操作、自动监测、指示判断、数据处理、故障诊断等，并配有光盘。主机还配有预留接口，可通过外部贮存器自动处理其它数据，并摇控操作，用于实验室自动化延伸发展。
4.2.2.2 全自动微粒子化学发光免疫分析系统
    全自动微粒子化学发光免疫分析系统采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成分以及药物浓度进行定量测定。系统具有高度的特异性、高度的敏感性和高度的稳定性等特点。
1．分析方法及过程 采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为发光剂，固相载体的应用扩大了测定的范围。以竞争法、夹心法和抗体检测等免疫测定方法为基础：
(1)抗原抗体结合 将包被单克隆抗体的顺磁性微粒和待测标本加入反应管中，标本中的抗原与微粒子表面的抗体结合，再加入碱性磷酸酶标记的抗体，经温育后形成固相包被抗体—抗原—酶标记抗体复合物；(2)洗涤、分离 (3)加入底物 (AMPPD)发光剂 ，AMPPD被结合在磁性粒子表面的碱性磷酸酶的催化下迅速去磷酸基因，生成不稳定的中介体AMPD，AMPD很快分解，从高能激发态回到低能量的稳定态，同时发射出光子，从标准曲线上计算出待测抗原的浓度。
2．仪器组成 一般由微电脑控制、样品处理系统、实验运行系统、中心供给系统和中心控制系统四部分组成。
4.2.2.3 全自动电化学发光免疫分析仪
    电化学发光免疫分析技术在新一代实验室免疫检测技术中很有特点，它在20世纪90年代一问世就引起广泛的关注。德国公司在链酶亲和素—生物素包被技术基础上，引用电化学发光免疫分析技术并开发出相应的检测系统。
1．测定原理及过程 该类分析仪集多种技术于一身，应用了免疫学、链酶亲合素生物包被技术及电化学发光标记技术。将待测标本与包被抗体的顺磁性微粒和发光剂标记的抗体加在反应杯中共同温育，形成磁性微珠包被抗体—抗原—发光剂标记抗体复合物。复合物吸人流动室，同时用TPA缓冲液冲洗。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下的磁铁吸引住，而游离的发光剂标记抗体被冲洗走。同时在电极加电压，启动电化学发光反应，使发光试剂标记物三氯联吡啶钉[Ru(bpy)3]2+TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比。
2．仪器组成及特点 主要由样品盘、试剂盒、温育反应盘、电化学检测系统及计算机控制系统组成，该类仪器特点为：①测定速度快、 ②样品盘可放置较多标本、③试剂盘带有内置恒温装置，以利于试剂保存。④全自动二维条码识别系统⑤灵敏度高。 按照免疫学的方法原理可应用三种抗原抗体反应方法：抑制免疫法用于小分子量蛋白抗原检测；夹心免疫法用于大分子量物质检测和桥联免疫法用于抗体如IgG、IgM检测。还有钌标记用于DNA／RNA探针分析。
4.2.3 发光免疫分析仪的临床应用
1．甲状腺系统 检测总T3、总T4、游离T3、游离T4、促甲状腺素、超敏促甲状腺素、T3摄取量等；
2．性腺系统 检测绒毛膜促性腺激素、泌乳素、雌二醇、雌三醇、促卵泡成熟素、促黄体生成素、孕酮、睾酮等；
3．血液系统 检测维生素B12、叶酸、铁蛋白等；
4．肿瘤标记物 检测甲胎蛋白、癌胚抗原、CA153、CA125、CA199、β2－微球蛋白、前列腺特异抗原、游离前列腺特异抗原等；
5．心血管系统 检测肌红蛋白、肌钙蛋白、磷酸肌酶-MB等；
6．血药浓度 检测地高辛、苯巴比妥、苯妥英、茶碱、万古霉素、庆大霉素、洋地黄、马可西平等；
7．感染性疾病：检测Anti-HAV，Anti-HAV-IgM，HBsAg，Anti-HBc，Anti-HBs，Anti-HBe，HBeAg，Anti-HCV，HIV-Ag等；
8．其他 检测IgE、血清皮质醇、尿皮质醇、尿游离脱氧吡啶等。
4.3放射免疫分析
    放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。
4.3.1 放射性核素的种类特点和检测仪的基本结构与原理
4.3.1.1 放射性核素的种类和特点
    放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。
4.3.1.2 检测的基本结构原理、结构及其探测原理
    核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。
    液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。
    放射性活度测定方法 放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。无论是晶体闪烁计数仪还是液体闪烁计数仪都是将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能），电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记录的cmp值）反映了发出射线的频率，而电脉冲的电压幅度则反映了射线能量的高低。
    计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。如果知道这个测量系统的效率，还可算出放射源的强度，即dpm（衰变/分）或dps（衰变/秒）。
4.3.2 晶体闪烁计数器组成和工作原理
晶体闪烁计数器又称γ放射计数器，主要用于检测如125I、131I、57Cr和60Co等产生的γ射线。
4.3.2.1 仪器组成及工作原理
（1）闪烁体 闪烁体是将核辐射能激发分子转化成可探测闪光的荧光物质。常用的有有机闪烁体、无机闪烁体和特殊闪烁体等。
（2）光电倍增管 光电倍增管的作用是有选择性地把闪烁体发出的极弱闪光的一部分转换成电信号。光电倍增管的基本结构主要包括光电转换、电子倍增和电子收集装置三个部件。
在医学检验中，用于体外样品放射性测量的井型NaI、Tl、）闪烁探测装置中的晶体及光电倍增管等是装在一只有盖的铅室中的。由于探测效率和探头相对于样品的几何位置关系十分密切，测量中要特别注意。还要避免样品对探头的污染，一旦造成污染，要及时进行有效的去污处理，以免使仪器本底增高，影响装置性能指标。
（3）多道脉冲分析器 多道分析器（MCA）是进行能谱分析的重要仪器，现代的MCA与通用微型计算机有许多共同特性，是现代核探测分析及放射影像装置的重要组成部分。
①脉冲高度分析器的基本原理 比例放大器、甄别器和反符合电路三部分组成了典型脉冲高度分析器的主体。
由光电倍增管产生的输出脉冲与γ射线等在NaI、Tl等闪烁体内失去的能量成正比。将此脉冲信号输入放大器进行放大，由于输入脉冲高度与输出脉冲高度是按比例设计的，该放大器称比例放大器。经比例放大的脉冲信号再被送入甄别器。由上限和下限两个甄别器组成，分别让脉冲高度高于下限甄别器预定电压U的信号及高于上限甄别器预定电压U+△U的信号送入反符合电路。反符合电路有选通特性，输入脉冲只有一路进入时，便输出一个脉冲，否则电路无脉冲输出。于是整个电路只选取了脉冲高度在U和U+△U的信号进行计数。如果设定△U值，逐渐变换U并读出计数值，便可获得γ射线在晶体内所失出的能量分布状态，即能谱。其中U称阈电压，△U称窗电压或窗宽。
②多道分析器（MCA） 多道分析器的基本组成部分是模-数变换器（ADC）和存储器。每个存储单元都是一个独立的计数器。进入分析器的所有脉冲按多路定标方式以幅度大小安排在各个存储单元中计数，直到全部存储器都被寻址为止。这种工作方式的净效应就是提供和分析器道数相等数量的一些独立的计数器进行脉冲高度分析计数，各计数器再把每一顺序时间间隔内的总计数记录下来，完成多路定标的脉冲高度多道分析。
③γ能谱分析 γ射线可以通过光电吸收、康普顿散射、电子对产生三种机制与物质发生作用。NaI、Tl等闪烁体可以将作用时损失的能量在能谱仪中记录下来。能谱的横坐标为脉冲高度，纵坐标为一定时间内所测到的各个脉冲高度（在一定宽度范围内）的频数。能谱中高峰部位是由光电吸收而形成的光电峰，又称全能峰，是放射性核素的标识峰。能谱中占份额较大的是康普顿坪。高能γ射线还会形成电子对产生的逃逸峰。峰的面积和γ射线的强度成正比，γ能谱分析就是根据能谱中各标识峰面积的相对比例来测定样品中放射性的组成，因此根据峰的位置和面积可对放射性核素进行定性和定量分析。
4.3.2.2 γ-辐射计数器
（1）工作原理 γ辐射计数器主要用于125I、131I等以及能量在400KeV以下γ或X放射线的探测。
γ-辐射计数器以NaI，并掺入少量的铊（Tl）晶体为探测元件。使用铊激活的晶体对γ辐射的吸收高，荧光产额高，时间分辨能力强。当样品位于晶体井内时，晶体吸收125I释放的γ射线能量后，使闪烁晶体处于受激状态，受激的原子或分子在退激过程中将以闪光形式释放能量。晶体发出这一短暂的闪光称为光脉冲。光脉冲照射到光电倍增管的光阴极，打击出光电子，再经打拿极逐级放大，最后在光电倍增管的阳极获得电脉冲。
（2）系统组成 整机可分作采样部分和数据处理部分。采样部分由探头、换样装置、高低压电源、放大器及单道组成。数据处理部分由接口、计算机、输入输出装置等组成。
（3）使用中应注意的问题
①γ仪的机器效率一般用125I标准源（其放射性活度（用dpm为单位表示）由仪器制造厂提供）。放到测量井记下cpm值后算出的效率（效率=cpm/dpm）乘上1.25倍就得125I的效率,其效率一般应大于70％。若不到70％，首先微调高压到计数最大值，如仍达不到，则应对仪器作检查；②要防止探头部分的NaI晶体碰坏，晶体受潮后会发黄使效率下降。
4.3.3液体闪烁计数器基本结构和应用
    液体闪烁计数器是医学研究中常用的一种放射性测定仪器，多用于蛋白质(如细胞因子、激素等)对细胞增殖分化的影响或分泌表达蛋白质能力的研究。由于它是将样品混入闪烁体溶液内的，不存在样品中的射线自吸收，并可进行4π立体角的测量，成为3H、14C等低能β射线及α射线的最适宜的辐射探测装置。
4.3.3.1液体闪烁计数器的基本结构
    液体闪烁计数器的结构和性能不断发展，目前多采用双管快符合对称系统多独立道分析，与微机联用，实现了高度的自动化。
（1）基本电子线路 液体闪烁计数器的电路图主要由双管快符合、相加电路、线性门电路及多道脉冲幅度分析器等组成。
（2）自动换样器 自动换样器的使用不仅节省时间，还可使样品有足够的暗适应和温度平衡时间。样品传送机构类型较多，一般使用继电器控制的传送带、升降机、轮盘等。为了做到可靠的光密封，测量位置通道口设有快门、迷宫和转轮等。有的自动换样控制器还具备一定的识别功能，适应多用户需要。
（3）微机操作系统 多数仪器都可用微机进行工作条件选定、各种参数的校正、读取数据等操作。由于多采用键盘操作，并伴有显示屏指令提示，操作容易掌握。
4.3.3.2液体闪烁计数器的使用
（1）样品-闪烁液反应体系建立 样品和闪烁液按一定比例装入测量瓶，向光电倍增管提供光信号。
（2）猝灭 样品、氧气、水及色素物质等加入闪烁体中，会使闪烁体的荧光效率降低，出射荧光光谱改变，从而使整个测量装置的测量效率降低的过程称为猝灭。为减小猝灭，可在闪烁液中通氮气或氩气驱氧；将样品pH值调至7左右，避免酸的猝灭作用；对卟啉、血红蛋白等着色样品进行脱色处理等。
（3）计数效率测定 液体闪烁计数器通常用于放射性的相对测量，即通过样品的计数率与标准样品的计数率的比较来测定样品。由于标准样品与待测样品的猝灭情况不同，就需要对猝灭进行必要的校正来求出每个具体样品相对于标准样品的实际计数效率。常用的校正法有内源法，外源法和道比法等。目前广泛使用的是外部标准源校正法。
4.3.4 放射免疫分析仪的应用
    放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、可测定小分子和大分子物质，所以在医学检验中应用极为广泛。常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA-125、CA-199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，所以被广泛采用。近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，放射免疫分析有被取代的趋势。但在生物医学基础研究中，新发现的生物活性物质日益增多，对它们的研究也是基础医学科研中的热门课题。研究这些新的活性物质和某些疾病发生及发展的关系，需要高灵敏度、高特异性的检测方法，其中放射免疫分析技术仍为首选。
4.4免疫比浊分析仪
    临床上测定微量蛋白(如Ig等)由最初的试管沉淀反应、琼脂凝胶扩散试验，发展到现代自动免疫分析技术，其灵敏度逐步提高，检测水平由微克（μg)发展到纳克(ng)，甚至皮克(pg)水平。微量蛋白免疫分析随着自动化程度不断提高，在临床上得到广泛应用，其自动化检测方法主要为免疫比浊法。根据检测原理的不同，又分为透射比浊法和散射比浊法。

(1)稳定性好
(2)分析简便、快速
(3)避免污染；
(4)标本用量少
4.4.1 免疫比浊测定的基本原理
4.4.1.1免疫透射比浊测定
    免疫透射比浊度测定(turbidimetry)可分为沉淀反应免疫透射比浊测定和免疫胶乳浊度测定法。免疫比浊法测定的光路示意见图16-3。

图16-3免疫比浊法测定的光路示意图

1.免疫透射比浊测定原理：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过剩时，形成的复合物随抗原增加而增加，反应液的浊度亦随之增加。
2.免疫胶乳浊度测定法原理：选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝集时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝聚成正比。
4.4.1.2激光散射浊度测定
    激光散射浊度测定(nephelometry)按测试的方式不同分二种比浊法：即终点散射比浊法(end nephelometry)和速率散射比浊法(rate nephelometry)。
    激光散射浊度的基本原理是：激光散射光系沿水平轴照射，通过溶液时碰到小颗粒的抗原—抗体免疫复合物时，导致光线被折射，发生偏转。偏转角度可以从00C ~900C，这种偏转的角度可因光线波长和离子大小不同而有所区别。散射光的强度与抗原—抗体复合物的含量成正比，同时也和散射夹角成正比，和波长成反比。
1. 终点散射比浊法 在抗原—抗体反应达到平衡时，即复合物形成后作用一定时间，通常为30~60分钟，复合物浊度不再受时间的影响，但又必须在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。因此，终点散射比浊法是测定抗原与抗体结合完成后测定其复合物的量。
2.速率散射比浊法 是一种先进的动力学测定法。所谓速率是指在抗原—抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。因此，速率散射比浊法是在抗原与抗体反应的最高峰(约在1分钟内)测定其复合物形成的量，该法具有快速、准确的特点。
速率法的灵敏度和特异性都比终点法好，前者的灵敏度可比后者高3个数量级之大。自动化速率法的精密度也较好，但这与仪器的质量和性能关系密切。浊度法速率法的校正结果也较稳定，故可贮存使用一定时间。
4.4.2免疫比浊分析仪的种类和检测原理
    免疫透射比浊测定用自动生化分析仪进行检测，虽可达到快速混匀目的，但IC很可能在离心力作用下沉淀，引起误差。如果抗原或抗体量大大过剩，出现可溶性复合物，对于单克隆蛋白的测定，这种误差更易出现，另外还可受血脂浓度的影响，造成假性升高。
    激光散射浊度测定特别是速率散射比浊法具有快速、准确、灵敏度和特异性好的特点，在临床上已推广应用，下面介绍目前国内常用的该类仪器。
4.4.2.1 ARRAY特种蛋白分析测定系统
    由微电脑控制，可以定量检测体液中微量蛋白的全自动组合仪器。
    仪器主要部件：散射测浊仪、、加液系统、试剂和样品转盘、分析仪上阅读器
    仪器主要特点：速率信号的获取； 抗原过剩的监测；使用抗体、标准血清、抗体卡片和校正卡片，保证测定结果的准确性和精密度。
4.4.2.2 DBl00特种蛋白分析测定系统
    仪器组成 DB 100特种蛋白分析测定系统，由分析仪、计算机(主机、CRT显示屏和键盘，用于数据输入和程序运行的操作，并可在显示屏上显示出来)、打印机、条码读取器四部分组成。分析仪是该系统的主要部分，包括散射测浊仪、加液系统、支架运输装置、比色杯装置等。
    仪器主要特点：其测定方法实质上是透射比浊的一种改良，利用发光二极管(840nm)作为光源，检测在前向角130C~240C的散射光，由硅化光电二极管接收散射光信号，这种散射光的强度与免疫复合物浓度成正比。散射光电信号与贮存在计算机内的标准曲线进行比较，然后转换成检测物的浓度单位。
4.4.2.3 IMMAGE免疫分析测定系统
    IMMAGE免疫分析测定仪是继ARRAY 360CE特种蛋白分析测定系统之后，推出的新一代全自动特种蛋白分析、药物浓度监测为一体的免疫分析系统。
    IMMAGE免疫分析测定仪使用760nm和近红外940nm波长作为光源，采用速率散射比浊(Rate Nephelometry)、速率抑制散射比浊(Rate Inhibition Nephelometry)、速率近红外颗粒透射法(Rate Nearh—frared Particlemmunoassa)、速率抑制近红外颗粒透射法(Rate lnhibition Near lnfrared Particle lmmunoassay )四种检测技术，并采用不同的散射角度测量发散的散射光强度，90角度的散射法测定小颗粒(直接反应产物)，0角度的透射度检测大颗粒(抗体颗粒结合物)，扩大检测免疫项目范围，增强了检测敏感度和精度，减少了非特异性颗粒的干扰。
    IMMAGE免疫分析测定仪加大抗原过量检测范围以区分非特异性反应使检测结果更加准确可靠，添加了试剂冷藏系统增加试剂的稳定性，采用全方位的条形码系统可以自动检测试剂及试剂的批号、校正的状态、试剂过期的日期、试剂的体积及质控、标准和样品标本，具有双试剂加样探针(避免交叉污染)和智能液面感应器，处理标本自动化程度高(75—180测试／h)。
4.4.2.4 BN Prospec特种蛋白免疫分析仪
    BN Prospec特种蛋白免疫分析仪是2000年推出的新一代全自动特种蛋白免疫分析系统，仪器由主机、计算机、显示器和打印机组成。使用远红外发光二极管作为光源，采用固定时间散射比浊(Fixed time Nephelometry)、终点散射比浊(Final Measurement Nephelometry )和Vlin—Integral散射比浊法三种检测技术，部分试剂采用了乳胶增强剂，提高反应灵敏度，大大加强检测范围。
    BN Prospec特种蛋白免疫分析仪主机由样品盘、冷藏试剂盘、稀释盘、反应盘、探针和注射器组成。
4.4.3 免疫比浊分析的临床应用范围
1．免疫功能监测 免疫球蛋白A、免疫球蛋白C、免疫球蛋白M、免疫球蛋白轻链?、免疫球蛋白轻链λ、补体C3、补体C4、C－反应蛋白等。
2．心血管疾病检测 载脂蛋白A1、载脂蛋白B、脂蛋白a、C—反应蛋白等。
3．炎症状况监测 C—反应蛋白、α1—酸性糖蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白等。
4．类风湿性关节炎的检测 类风湿因子、C—反应蛋白、抗链O等。
5．肾脏功能监测 微量白蛋白、α1—微球蛋白、β2—微球蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G等。
6．营养状态监测 白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白等。
7．新生儿体检 C—反应蛋白、免疫球蛋白A、前白蛋白、免疫球蛋白G等。
8．凝血及出血性疾病的检测 抗凝血酶Ⅲ、转铁蛋白、触珠蛋白等。
9．贫血监测 触球蛋白、转铁蛋白等。
10．血脑屏障监测 脑脊液白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M。
4.5 时间分辨荧光免疫分析仪
    荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的/游离的荧光标记物而分为均相和非均相两种类型，基本反应式如下：Ab*+Ag→Ab*Ag+ Ab*(Ab*Ag代表结合的标记物，Ab*为游离的标记物)。在抗原抗体反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称为非均相荧光免疫测定法，如时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay, TRFIA)本章节重点介绍非均相荧光免疫测定法的时间分辨荧光免疫测定仪。
4.5.1时间分辨荧光免疫检测原理
    该技术的基本原理为：用镧系三价稀土离子及其螯合物(如Eu3+ 螯合物)作为示踪物标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、巨大Stokes位移、荧光寿命长），用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光，测定免疫反应最后产物的特异性荧光信号。根据荧光强度判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。
    与一般的荧光分光光度仪不同，时间分辨荧光分析仪的激发光与荧光的波长差别显著，其波长转变达280nm，采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯)，

图16-4 时间分辨荧光原理

    照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异荧光本底衰退后，再测定样品发出的长寿命镧系荧光。
时间分辨荧光免疫分析的特点
    特异性强 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素，主要包括铕(Eu)、钐（Sm）、镝(Dy)、锝(Te) 四种。稀土离子的荧光激发光波长范围较宽，而发射光波长范围甚窄，同时激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移（大约290nm），如铕元素发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为280nm；这十分有利于排除非特异荧光的干扰，采用干涉滤波片就可以消除散射光引起的干扰，从而提高了荧光信号测量的特异性。
    灵敏度高 稀土离子鳌合物所产生的荧光不仅强度高，而且半衰期长（例如：铕元素的半衰期为430μs，普通荧光免疫分析中荧光团的衰变时间只有1～100μs，样品中的一些蛋白质的荧光衰变时间仅为1～10μs），因此利用延长测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后再测稀土离子鳌合物的荧光信号，即将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来消除了来自样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏度，同时扩大了检测范围。
    标记物稳定 三价稀土离子与双功能鳌合剂鳌合，形成稳定的鳌合物，从而使标准曲线稳定，试剂保质期长。时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标。
    线性范围宽，重复性好 解离－增强时间分辨荧光免疫分析法（DELFIA）荧光检测分析中加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，并和增强液中的一些成分形成一种稳定的微囊，当微囊被激光激发后则稀土离子发出长寿命的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强100万倍。
4.5.2 时间分辨荧光免疫分析仪测试原理和基本结构
    目前国内已经开发生产出不同型号的时间分辨荧光免疫强度测试仪/分析系统，并有相应配套试剂可供临床实验室选用，现将该类分析仪的测试原理和基本结构介绍如下。
为了解该类仪器的基本结构，工作原理和使用方法，以DELFIA 1230时间分辨荧光仪为例作一介绍，见图16-5。

图16-5 DELFIA1230时间分辨荧光仪的原理图

    在该系统中，氙闪烁灯是脉冲激发光源，脉冲宽度10ps，频率为1000次／秒。激发光经二个石英透镜和一个滤色片把激发光束聚焦到被测样品，滤色片选出的激发光波长是340nm。半透明镜反射部分激发光束到光电二极管，它测量激发光的光通量，而且当激发样品的光能达到规定量时，停止氙灯闪烁，以保证每个样品得到相等的激发能。每测量一个样品是由约1000次激发一测量循环组成的，每个循环的持续时间是l ms。由定标器累积记录荧光计数。反复闪烁的激发光能量的总和用光电二极管一反馈电路积分，当达到了预置的阈电压水平，闪烁灯的驱动器停止其闪烁。因此，它是用控制激发脉冲数来稳定激发能量，而不是用调节闪烁能量来稳定激发能量。
    激发光穿过样品管(孔)的侧面激发样品，而样品的发射光则穿过孔的底部后被测量，这样激发光和发射光的方向成直角，减小前者对后者的干扰。类似用于激发光的一组透镜被用来聚焦发射光速。透镜之间有一个窄带干涉滤色片，选出相关的发射波长，对Eu即为615nm。最后这个透镜聚集615nm波长发射光束进入探测器一光电倍增管，它是侧窗式的，其光阴极是红光敏感的多碱光阴极，它有良好的光谱响应。经严格选择的光电倍增管，以保证暗电流低和温度效应稳定。
    光电倍增管输出脉冲由—个快前置放大器放大，而后送到前置定标器，在测量周期完成后，微处理机读取定标器中的内容而且存储这累积计数。
    DELFIAl230时间分辨荧光仪是测量Eu单标记样品的，其通常测量条件为延迟时间400μs ，测量时间400μs ，仪器恢复时间200μs，一次循环共l ms。测一个样品约经1000次循环，需时1s。最后计数是这1000次循环中所测计数之累积。
    固相分离：在解离增强之前，需要分离镧系元素(如Eu)标记抗体的结合部分与未结合部分。最方便的方法是利用固定免疫反应物的固相支撑材料进行分离。随着TRFIA技术的发展，试用了聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯碳酸酯等多种塑料，它们都能结合蛋白，但磷光本底则不同。目前在TRFIA中最常用的是聚苯乙烯板条，通常一板含8个分离的条，每条12孔。这是因为聚苯乙烯的磷光本底低，而且又有洗涤板条的自动装置。值得注意的是不同厂家用同样原棚料生产的板条，其磷光本底也有很大差异，应进行选择。
    把在一种适宜的缓冲液中的足够量的抗体或抗原加入聚苯乙烯微滴定板条孔中，然后温育，借助物理吸附，就能完成抗体或抗原的包被。如果用一种载体蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，作稳定剂。包被抗体可在几个月内保持稳定。对于小分子抗原和半抗原可用同样办法包被，但在包被之前先要把它们连接到一种非免疫反应载体蛋白(non—immunoreactive carrier protein)上，如对考的松和睾酮用卵蛋白作载体蛋白，而对地高辛则用兔血清白蛋白作载体蛋白。
    应用这种易于处理，易于洗涤的固相分离技术，可减少分析中的非特异荧光，提高灵敏度。而且在双位点夹心法分析中，使用固相分离技术，则可以加入高过量标记抗体，可使反应加快，而且延长标准曲线的线性段。

4.5.3时间分辨荧光免疫分析的应用
4.5.3.1蛋白质和多肽激素分析
    一般多使用双位点“夹心” 法测定免疫球蛋白E、人绒毛膜促性腺素、磷脂酶A2、胰岛素、C反应蛋白、促黄体生成素、催乳素、髓磷脂碱性蛋白、铁蛋白、卵泡刺激素、促甲状腺素等自分析等。
4.5.3.2半抗原分析
    用竞争结合荧光免疫分析法测定皮质醇、睾丸酮、地高辛、前列腺素F、甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸、孕酮、孕烷二醇、雌二醇、雌三醇、雌酮、葡萄糖醛酸等。
4.5.3.3病原体抗原/抗体分析
    如肝炎病毒表面抗原抗体、蜱致脑炎复合病毒抗原、免疫缺陷病毒抗体、粪便中腺病毒和轮状病毒、Potato病毒、流感病毒A、鼻病毒、衣原体、肠病毒、梅毒螺旋体、乳头瘤病毒和呼吸道合胞病毒等分析。
4.5.3.4肿瘤标志物分析
    例如，甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异抗原、神经原特异烯醇酶、CA50、CA242、CAl99、β2—微球蛋白和甲状腺结合球蛋白等的分析。
4.5.3.5干血斑样品分析
    把有血样品的滤纸片放在装有分析缓冲液的孔中，振荡使抗原溶于缓冲液中。本法特别适用于新生儿和远离分析中心的病人
4.5.3.6核酸分析
    时间分辨荧光分析应用于核酸分析领域主要有两个方面。一是应用镧系元素标记的DNA探针技术进行杂交分析；二是将镧系元素标记技术引入聚合酶链反应(PCR)中，简单、快速地鉴定PCR产物。样本核酸不必经过电泳，直接点样到滤膜或微孔中进行杂交，即引入杂交体系中的Eu3+，在加入增强液后测量。或者用Southern印迹杂交与Northern印迹杂交，固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上与Eu3+标记的核酸探针进行杂交分析。引入杂交体系的Eu3+螯合物可在固相下测量，因而可在时间分辨荧光扫描仪下进行准确定位并检测特异的DNA或RNA电泳条带。另外，尚有嵌套式PCR—TRF技术和把TBP(Eu3+)与快速收集系统相结合测定特异放大的靶DNA。
4.5.3.7测定天然杀伤细胞的活力
    用Eu3+—DTPA(Eu3+—二乙三胺五醋酸盐)标记肿瘤细胞，作为NK细胞的靶细胞。当这靶细胞受到NK细胞毒害时会释放Eu3+—DTPA标记物。用时间分辨荧光仪测量所释放的这标记物的荧光，即可测量NK细胞的活力。本法温育时间短，一般只用2h，测量快速，每样品只需1s；灵敏度高，可测至单个细胞。
    TRFIA优点突出，研究工作活跃，发展迅速。新的仪器、试剂和方法不断出现。应用范围日益扩大和普遍。目前已有30多种试剂盒和成套仪器、试剂面世，成为一种新的很有潜力的免疫分析技术，倍受重视。我国在仪器、试剂、方法和应用等方面的研究已取得了较大进展，有商品面世，投入实际使用。
    除了上述几种主要的免疫分析方法外，目前还发展了核酸免疫、免疫PCR技术、DNA免疫、基因免疫技术等高专一性、高灵敏性的技术。从测定原理和应用上看，免疫分析的发展将存在两条并行的路线。一是免疫分析法继续在分析的可靠性和灵敏性上不断的革新、完善和进步，为生化研究和临床分析提供更为准确和实用的新方法；二是伴随现代生物技术的不断发展，免疫分析将渗透到各种全新的研究领域，这将集中表现在以下方面：①基因工程抗体（gene-engineering Ab，又称recombination Ab）的应用；② 催化抗体（catalytic Ab）的应用；③ 新原理的多组分测定（multiresidue IA）；④ 金属离子的免疫分析。